Metoder för DNA-, RNA- och proteinanalys
🧬
Daniel Fürth
Assistant professor
SciLifeLab/Uppsala University
🔗 furthlab.xyz
@furthlab
🛠🧰 Restriktionsenzymer 🧬
🇺🇸 Restriction och modifikations-enzymer 🇨🇭
Nobelpris: 🇺🇸 Hamilton O. Smith, 🇺🇸 Daniel Nathans, and 🇨🇭 Werner Arber.
🛠🧰 Restriktionsenzymer 🧬
Blunt ends
Sticky ends
Rekombinant DNA
Ligering av sticky och blunt ends
Kloning
DNA bibliotek
RNA och cDNA
Elektrofores och separationskemi
Electrophoretic machine as designed by Tiselius
Elektrofores
Agarose gel electrophoresis
Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)
- Length
- Charge
- Confirmation
Molecules can be run in their “native state”
preserving higher-order structure.
Or a chemical denaturant can be added to
remove structure (urea for 🧬).
Native vs non-native PAGE.
Pore size controled by % of acrylamide.
📏 Resolution:
100-1000 nt down to single-nucleotide.
DNA hybridisering
- Denaturering: separering av vätebindningar mellan dubbelstrandade nukleinsyror (DNA/RNA).
- Annealing: Vätebindninga skapas mellan två enkelsträngade (single strand) nukleinsyror (DNA/RNA).
Melting temperature: temperaturen då 50% av ett DNA duplex dissocierar och blir enkelstrandat (single stranded).
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Design av PCR Primers
Design av PCR primers
Primers för: - Nucleocapsid - N1 - N2 - N3 - RNase P
Design av PCR primers
Design av PCR primers
Design av PCR primers
Sanger sequencing
Dideoxynucleotides (ddNTP) inkorporeras av DNA polymeras
Polymeras kan inkorporera ddNTPs (dideoxynukleotider) och inte enbart dNTPs (deoxynukleotider).
Enbart en kvävebas inkorporeras, sen termineras polymeriseringen.
Ingen fri 3’hydroxyl grupp (3’OH).
🏆 Chain-termination method 🏅
“Sanger sequencing”
Next-generation sequencing
- Solid support: PCR bridge amplification
- Primer extension: Reversible dye-terminators (
patent 444 about to expire!)
Next-generation sequencing
Democratization of sequencing
Analytiska tekniker för proteiner
Affinitetsbaserade protein metoder
Dessa metoder är ej bra beskrivna i läroboken.
Antikroppar:
- Monokonala: härstammar från en och samma cellklon.
- Polyklonala: härstammar från flera cellkloner.
Western blot: Relativ mängd och molekylmassa kan läsas av från SDS-PAGE.
Immunohistochemistry (IHC): Binding av antikroppar direkt i vävnadssnitt (histologi) för visualisering under mikroskop.
ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Görs på plattor med en färgreaktion som indikerar koncentrationen av antigen. Eva Engvall och Peter Perlmann (1971), Stockholms Universitet.
Masspektrometri
